EFECTO DE LOS FACTORES SOLUBLES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS, STAPHYLOCOCCUS CAPITIS Y STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS SOBRE LA FUNCIONALIDAD ESPERMÁTICA

INTRODUCCIÓN

Las infecciones del tracto urinario son la causa más común de infecciones bacterianas en el mundo y son responsables de una alta morbilidad (1). Se estima que por centro de salud, existen aproximadamente 10 casos por cada 1000 pacientes al día (2), con una prevalencia que varía de acuerdo a las especies bacterianas, siendo E. coli la más común con un 62,7%, seguido del grupo de Klebsiella, Enterobacter y Serratia con 9,7% y Staphylococcus aureus con 4,0% (3). Aproximadamente la mitad de las mujeres experimentan al menos una infección del tracto urinario durante su vida (4), sin embargo, en hombres éstas son generalmente asintomáticas y se caracterizan principalmente por afectar sitios anatómicos del tracto reproductivo, como las vías urinarias, los testículos, el epidídimo y las glándulas sexuales accesorias (5), por lo que se presume que los espermatozoides durante su desarrollo, maduración o transporte pueden interactuar con algunas especies bacterianas, o los factores solubles producto del metabolismo bacteriano (6-8); inclusive se estima que al menos el 15% de los casos de infertilidad masculina son consecuencia de algún tipo de infección bacteriana (6). Aunque no siempre la presencia de bacterias en el semen -bacteriospermia- culmina en infección, la sola existencia de algunas especies bacterianas o de los factores solubles producto de su metabolismo, pueden desencadenar una serie de efectos negativos que inflyen directa o indirectamente en la disminución de la calidad seminal (9-11). Esta alteración es observada no solo en términos de la movilidad y la viabilidad, sino en los parámetros funcionales (9-19), lo cual fialmente impactaría sobre la función reproductiva masculina. Adicionalmente, se ha demostrado que la prevalencia de bacteriospermia en hombres con alteraciones en la reproducción varía, con prevalencias que van desde el 25 al 100% (20-22), por lo que un alto porcentaje de los casos de infertilidad idiopática, pueden deberse a la presencia de especies bacterianas difíciles de diagnosticar (8), con el agravante que estos casos de infecciones del tracto reproductivo no son de reporte obligatorio en el sistema de salud colombiano y no son evaluadas de rutina. S. aureus es un microorganismo oportunista que coloniza la piel, las fosas nasales, las axilas, la faringe y el tracto urogenital en aproximadamente el 20% de personas sanas (23,24); es la bacteria más frecuentemente aislada en las infecciones asociadas al cuidado de la salud, con el 5 a 40% de los casos (25); presenta mecanismos de resistencia a antibióticos debido a la transferencia horizontal de los genes de virulencia, que han contribuido a la aparición de cepas resistentes a oxacilina (meticilina) como las cepas portadoras del gen mecA que codifia una proteína de unión a penicilina (26). Además esta bacteria pertenece a la microbiota predominante de hombres infértiles con una disminución signifiativa de la movilidad espermática (27), pero son pocos los estudios que se han realizado incubando los factores solubles del metabolismo bacteriano con los espermatozoides y evaluando su efecto sobre las pruebas funcionales. Dentro del grupo de los Staphylococcus coagulasa negativo se encuentran las especies S. capitis y S. epidermidis, las cuales son las principales responsables de las infecciones del tracto reproductivo masculino después de E. coli (28,29).Estas bacterias poseen una serie factores de adherencia, toxinas y polipéptidos implicados en su patogenicidad tales como la hemolisina, las leucocidinas y las enterotoxinas (25,30,31), que pueden inflir en el detrimento de la calidad seminal. Teniendo en cuenta que durante los procesos infecciosos las bacterias o los factores solubles producto de su metabolismo, pueden afectar la fiiología de los espermatozoides, el objetivo del estudio fue determinar el efecto de los factores solubles bacterianos de S. aureus, S. capitis y S. epidermidis sobre los parámetros seminales convencionales y funcionales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas. Se emplearon las cepas S. aureus sensible (ATCC 29213) y resistente a la oxacilina (aislado clínico), además dos cepas de Staphylococcus coagulasa negativo (aislados clínicos): S. capitis sensible y S. epidermidis resistente a oxacilina. La cepa de S. epidermidis fue resistente al tratamiento con ciproflxacino, levoflxacino, eritromicina, clindamicina y trimetoprima/sulfametoxazol.

Obtención de los factores solubles. Los factores solubles de las cuatro cepas de bacterias, se obtuvieron incubando durante 30 minutos un inó- culo de cada bacteria a una concentración de 0,5 Macfarland en solución salina. Posteriormente, el medio se centrifugó a 600 g/10 minutos, se recolectó el sobrenadante y se fitró por una membrana de 0,2 µm (Advantec Industries, China), se alicuotó y se almacenó a -20ºC hasta su uso.

Muestras de semen. Se emplearon 20 muestras de semen de voluntarios aparentemente sanos, mayores de 18 años con parámetros seminales iguales o superiores a los límites inferiores de referencia establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (32,33). Las muestras de semen fueron colectadas por masturbación en un recipiente estéril, después de una abstinencia sexual de 3 a 5 días y analizadas máximo 2 horas después de su recolección. A cada muestra de semen se le determinaron los parámetros seminales convencionales como el volumen, la movilidad, la viabilidad (33) y la concentración usando la cámara de Makler (SefiMedical Instruments, Israel) (34).

Evaluación de los factores solubles de las bacterias sobre la movilidad espermática y sobre los parámetros funcionales. Se realizó la incubación de los espermatozoides con los factores solubles en proporción 1 a 1,50 µL de semen y 50 µL de factores solubles en un volumen fial de 100 µL, a 37°C/60 minutos con el fi de determinar por microscopía su efecto sobre la movilidad espermá- tica, evaluada cada 15 minutos durante un lapso de una hora. Los resultados son expresados como porcentaje de cambio en la movilidad, que es la relación entre el porcentaje de movilidad con los factores solubles respecto al control. Adicionalmente, se incubaron 150 µL de semen con 150 µl de los diferentes factores a 37ºC/1 hora, se tomaron alí- cuotas de 2 x 106 espermatozoides para evaluar cada uno de los siguientes parámetros funcionales: potencial de membrana mitocondrial, integridad de la membrana plasmática, lipoperoxidación de la membrana, fragmentación de la cromatina, detección temprana de apoptosis y producción intracelular de especies reactivas de oxígeno (ERO) mediante citometría de fljo (CoulterEpics XL BeckmanCoulter, CA, USA) analizando entre 5.000 y 10.000 espermatozoides.

Detección del potencial de membrana mitocondrial espermática. Los espermatozoides se incubaron con ioduro de propidio (IP, Molecular Probes®Inc, OR, USA) [0.25mg/mL] y 3,3’dihexiloxacarbocianina (DIOC6, Molecular Probes®) [10 nM] a 37°C/30 minutos; los espermatozoides se lavaron una vez centrifugando a 300g/5 minutos. El botón fue resuspendido en PBS y se realizó la lectura en el citómetro de fljo como había sido previamente estandarizado en el Grupo Reproducción (19).

Determinación de la integridad de la membrana espermática. Siguiendo el protocolo previamente establecido (19), los espermatozoides se incubaron mezclaron con IP (concentración fial 0,25mg/mL) y Sybr 14 [1 µM] (LIVE/DEAD® SpermViability Kit, Molecular Probes®)a 37°C/30 minutos, se lavaron una vez con PBS, se resuspendió el botón y se realizó la lectura en el citómetro de fljo.

Análisis de la lipoperoxidación de la membrana espermática. Se incubaron los espermatozoides con 4,4-difloro-4-bora-3a-4a-diaza-s-indaceno (BODIPY C11Molecular Probes®Inc, OR, USA) a 37°C/30 minutos, los espermatozoides se lavaron una vez y fueron resuspendidos en PBS antes de realizar la lectura en el citómetro de fljo (14).

Evaluación de los niveles de especies reactivas de oxígeno intracelulares espermáticas. Los espermatozoides se incubaron con di-acetato de 2’,7’ diclorofloresceína (DCFH-DA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) [1 µM] y IP [0,25mg/mL] a 37°C/5 minutos, se lavaron 3 veces, el botón fue resuspendido en PBS y se realizó la lectura en el citómetro de fljo siguiendo el protocolo previamente establecido (19).

Detección de la integridad de la cromatina espermática. Se diluyeron los espermatozoides en buffer TNE (TRIS-HCl, NaCl, EDTA – disódica, pH: 7,4). Justo antes de leer la muestra en el citómetro de fljo, se adicionó 400 µL de solución detergente ácida (HCl, NaCl, Tritón X-100, pH: 1,2) y 30 segundos después se adicionó la solución colorante naranja de acridina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA, 0.006 mg/mL), fialmente se realizó la lectura en el citómetro de fljo siguiendo el protocolo previamente establecido (17-19,35).

Detección de eventos apoptóticos tempranos. A la suspensión de espermatozoides se les agregó el buffer de unión a una concentración de 1X (10X Annexin V Binding Buffer, Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA), se centrifugó a 300g/5 minutos y se descartó el sobrenadante. Se adicionaron 3 µL de Anexina V FITC, se incubó a 37°C/30 minutos y se agregó 1,5 µL de IP incubando durante 5 minutos, se lavó una vez con con PBS (Gibco®, NY, USA) y se realizó la lectura en el citómetro de fljo (13).

Análisis de datos. Los resultados de las citometrías de fljo de cada parámetro funcional fueron grafiados y procesados utilizando los programas WinMDI 2.9 (The Scripps Research Institute, La Jolla – CA, USA) y Flow Jo 7.6 (Tree Star, Inc. Oregon, USA).En este estudio se aplicó estadística descriptiva (mediana y RIC -rango intercuartil-). Los resultados obtenidos se analizaron con estadística no paramétrica utilizando la prueba Wilcoxon, considerando signifiancia estadística un p<0,05, utilizando el programa Graph Pad Prism 5 (Graphpad, CA, USA).

RESULTADOS

Al incubar los espermatozoides humanos con los factores solubles producto del metabolismo de la bacteria S. aureus, se observó que los factores de la cepa sensible a oxacilina disminuyeron la movilidad desde un 25% a los 15 minutos, hasta aproximadamente un 40% a los 60 minutos respecto al control. Con los factores de la cepa resistente a oxacilina, el efecto negativo sobre la movilidad fue inmediato, observando una disminución del 20% que se mantuvo estable en función del tiempo desde los 15 segundos hasta una hora de incubación (Figura 1a).

Los factores solubles de la bacteria S. capitis sensible a oxacilina disminuyeron en un 30% la movilidad a los 30 minutos y el efecto se mantuvo en el tiempo. Por su parte, los espermatozoides incubados con los factores solubles de la cepa S. epidermidis resistente a oxacilina, presentaron un mayor deterioro en la movilidad a los 15 minutos de incubación y este efecto se mantuvo en un rango de 30% (Figura 1b).

30% (Figura 1b). El efecto de los factores solubles producto del metabolismo de las bacterias tanto sensibles como resistentes a oxacilina, sobre los parámetros funcionales de los espermatozoides se consolida en la Tabla I. Aunque las diferencias entre estas poblaciones con respecto al control, no fueron estadísticamente signifiativas se observaron cambios en el efecto de los factores solubles de cada cepa bacteriana entre ambas especies, siendo mayores los efectos de los factores solubles de la cepa S

aureus tanto sensible como resistente a oxacilina. Con respecto a la evaluación del potencial de membrana mitocondrial con DIOC6, los factores solubles de S. aureus sensible a oxacilina indujeron una disminución del potencial de membrana mitocondrial alto con respecto al control. Por su parte la determinación de la integridad de la membrana con el colorante SYBR evidenció un efecto negativo de los factores solubles de S. aureus sensible a oxacilina sobre las células viables, moribundas y necróticas respecto a su control (Tabla I).

Al evaluar la producción de especies reactivas de oxígeno en los espermatozoides incubados con los factores solubles de las cepas sensibles y resistentes de S. aureus y Staphylococcus coagulasa negativo, no se encontraron diferencias, sin embargo las intensidades medias de florescencia (IMF) disminuyeron con respecto al control.

Adicionalmente, se observó diferencias en el efecto de los factores solubles de S. aureus sobre la lipoperoxidación de la membrana celular de los espermatozoides, la cepa resistente presentó un mayor efecto que la sensible, y de ambas frente al control, aunque no fueron estadísticamente signifiativas. En la evaluación de la integridad de la cromatina espermática, no se observaron diferencias en el efecto de los factores solubles de las bacterias con respecto a su control. Finalmente, al utilizar anexina V como indicador de un estado proapoptótico, se encontraron diferencias en los tratamientos con los factores solubles de S. aureus, tanto en las cepas sensible como la resistente, y de ambas frente al control.

DISCUSIÓN

En este estudio se evaluó el efecto de los factores solubles de las bacterias S. aureus, sensible y resistente a oxacilina y dos cepas de Staphylococcus coagulasa negativo, S. capitis sensible y S. epidermidis resistente a oxacilina, sobre la calidad espermática de muestras seminales de individuos aparentemente sanos. La resistencia a oxacilina (meticilina) se ha convertido en un importante problema de salud pública y su prevalencia está aumentando a nivel mundial. Por ejemplo España pasó de 1,5% en 1986 a 29,2% en 2006 para S. aureus, mientras que Staphylococcus coagulasa negativo tuvo un cambio en la prevalencia de 32,5% en 1986 a 66,7% en 2006 (36,37). Por esta razón los controles en las entidades de salud son cada vez más rigurosos, por la complejidad que genera el tratamiento de las bacterias del género Staphylococcus que adquieren por transmisión horizontal el gen mecA que lo hacen resistente a una gran variedad de los antibióticos disponibles actualmente (26,38).

El grupo de los Staphylococcus que adquieren el gen mecA resistente a la oxacilina se han convertido en un principal foco de atención debido a su presencia en el tracto urogenital y el carácter asintomático de las infecciones por estos microorganismos en hombres (26,38). Los microorganismos que están presentes en el tracto urogenital masculino pueden estar afectando negativamente la calidad del espermatozoide (7,8) como ha sido reportado en individuos positivos para la infección por el VIH (39-41), sin embargo no se conocen los mecanismos de acción de las toxinas y factores de adherencia de las bacterias del género Staphylococcus sobre la calidad espermática. No obstante, otro microorganismo patógeno y con alta incidencia en el tracto genital masculino es E. coli, el cual ha sido estudiado por su capacidad aglutinante a través de sus factores solubles, como son las fibrias P y que inhiben la movilidad espermática hasta un 45% mediado por los receptores de manosa (42); estos receptores son las principales proteínas de unión entre los espermatozoides y las estructuras bacterianas que generan una pérdida de la movilidad de las células espermáticas (43). La concentración bacteriana produce efectos negativos en los parámetros convencionales espermáticos debido a que a mayor concentración bacteriana es mayor el detrimento de los parámetros (5). Estudios previos han demostrado una disminución de la calidad espermática y la infertilidad masculina cuando se da el contacto entre los factores solubles de E. coli y los espermatozoides (9,11).

En el presente estudio, la movilidad de los espermatozoides incubados con los factores solubles de la cepa S. aureus, mostraron una tendencia a la disminución y ésta fue mayor con la cepa sensible a oxacilina. S. aureus causó un detrimento en la movilidad espermática, no obstante, el hecho de que esta bacteria resistente cause un efecto negativo inmediato hace pensar que durante su crecimiento libera una alta concentración de moléculas al medio como exopolisacáridos, residuos de la cápsula, adhesinas (30), alfa-toxinas, leucocidinas y enterotoxinas (44) que puedan estar afectando la calidad de los espermatozoides

Con respecto a S. capitis y S. epidermidis se observó variabilidad en los datos lo cual podría deberse a que el efecto causado por estas bacterias no sea permanente y que el espermatozoide podría estar generando una estrategia para desprenderse de los factores solubles que en muchos casos pueden estar causando aglutinación o daños en el potencial de membrana, en la lipoperoxidación y en la liberación de ERO. Resultados similares se muestra en estudios previos con otros microorganismos bacterianos en los que el lipopolisacárido que puede estar presente en los factores solubles, induce la liberación de especies reactivas de oxí- geno y por ende en la pérdida de movilidad de los espermatozoides (45); además factores solubles de E. coli causaron disminución del potencial de membrana mitocondrial y translocación de la fosfatidilserina (11).

Continuando con los parámetros funcionales, se evidencia un efecto inhibidor sobre la movilidad espermática ejercida por los factores solubles de S. aureus sensible a oxacilina relacionada con el potencial de membrana mitocondrial y con la integridad de membrana, pero no se relaciona con la liberación de ERO, ni con la liperoxidación lipídica aunque estos se han relacionado en otros estudios con bacterias como E. coli (9). Los factores solubles de S. aureus sensible a oxacilina causaron disminución en el potencial de membrana mitocondrial, en la integridad de membrana y aumento del nú- mero de células necróticas. Aunque los resultados no sean estadísticamente signifiativos se pueden observar tendencias hacia el daño que producen los factores solubles de las cepas evaluadas sobre la movilidad espermática. Con respecto a los resultados de las cepas del grupo de los Staphylococcus coagulasa negativo no se observó una disminución de los parámetros funcionales espermáticos al incubarlos con los factores solubles.

CONCLUSIÓN

Aunque no hubo diferencias estadísticamente signifiativas en el efecto sobre los parámetros de los espermatozoides incubados con los factores solubles de las bacterias S. aureus, S. capitis y S. epidermidis, los resultados del estudio sugieren que la interacción de los espermatozoides humanos con los factores solubles de estas bacterias pueden afectar la calidad espermática y por ende la función reproductiva masculina.

AGRADECIMIENTOS: Este trabajo fue fianciado por Colciencias (111556933373) y por la Estrategia de Sostenibilidad 2014-2015, Grupo Reproducción, de la Universidad de Antioquia. Jenniffer Puerta Suárez fue Joven Investigadora de Colciencias.