MORFOMETRÍA DEL NUCLEOLO EN LA DIFERENCIACIÓN CELULAR DEL EPITELIO MAMARIO

INTRODUCCIÓN

Las células HC11 constituyen una línea de epite­lio mamario normal derivada del linaje COMMA 1D obtenidas de glándula mamaria de ratas BALB/c en mitad de preñez, las cuales retienen características de la diferenciación normal de la glándula y produ­cen ß caseína, la principal proteína de la leche (1). Las células mamarias normales en períodos de proliferación son estimuladas mediante el factor de crecimiento epidérmico (EGF), agente mitogé­nico, el cual unido a un receptor tirosina quinasa de membrana plasmática fosforilando proteínas cito­sólicas, origina una cascada de señales generando el mecanismo de la división celular y originando de este modo el tipo celular HC11 GM (2).
Estas células descritas son inducidas al proce­so de diferenciación por estimulaciones de prolac­tina, hormona que modula la transcripción de genes para ß caseína y promueve acúmulo de este RNA mensajero en el citoplasma (3). Del mismo modo, insulina y su funcionalidad anabólica, estimula la síntesis proteica de estas células epiteliales (4); de igual manera dexametasona, glicocorticoide que induce la diferenciación terminal de estas células mamarias, actúa sinergicamente con prolactina en la expresión del gen de ß caseína (5). Producto de dichas estimulaciones se genera el tipo celular HC11 IM.
A este respecto Taverna y cols (6), describie­ron que en las células HC11 GM, la activación de los receptores para EGF, es un paso esencial tan­to para el crecimiento celular, como para adquirir competencia en la respuesta a los estímulos de hormonas lactogénicas. De igual modo Hynes y cols (7), demostraron que las células HC11 IM sin­tetizan y secretan proteínas como las glicoproteí­nas laminina y tenascina tanto en ausencia como en presencia del EGF.
En este contexto, pareció interesante describir cuantitativamente las eventuales diferencias que pudiese experimentar el nucleolo, componente que, en base a su constitución ribonucleoproteica, genera una determinada tasa de biogénesis riboso­mal y por ende, en directa relación con una mayor o menor actividad en la síntesis proteica citosólica (8).

MATERIAL Y MÉTODO

Microscopía Electrónica de Transmisión: Al pellet que contenía las células HC11 GM (célula de glán­dula mamaria normal-proliferante) y HC11 IM (célu­la de glándula mamaria diferenciada) se le adicionó solución de glutaraldehído 2%, en tampón fosfato 0,15 M, pH 7,2 y se mantuvo a temperatura am­biente, por 2 horas. Posteriormente, fue sometido a un lavado en solución de 6 g de NaCl y 73 g de sacarosa, disueltos en 1 litro de agua destilada.
La post-fijación se realizó en solución de tetróxi­do de osmio 1%, disuelto en la solución de lavado antes descrita, durante una hora, a 40º C, y aceta­to de uranilo 0,5% por 18 horas. Luego de lavado el material fue deshidratado en concentraciones crecientes de acetona (30 a 100%) e incluido en Araldita 6005. Se obtuvieron cortes ultrafinos de aproximadamente 70 nm de grosor, los que fueron tratados durante 40 minutos con acetato de uranilo 2% y citrato de plomo 0,5% por 10 minutos.
Las muestras fueron estudiadas y fotografiadas en un microscopio electrónico Phillips EM 400. Método Estereológico: A partir de los bloques para microscopía electrónica, fueron obtenidos cortes ul­trafinos, en los cuales se micrografiaron cada uno de los tipos celulares con un aumento de 10.500 X. Para la evaluación de las fracciones volumétricas de los diferentes componentes celulares, fue so­brepuesto un retículo de puntos en las microgra­fías electrónicas y se procedió al conteo diferencial de los puntos que incidían sobre los perfiles de los componentes celulares, calculándose la fracción volumétrica que un determinado componente ocu­pa, mediante la siguiente ecuación:

Donde:
P = número total de puntos incidentes sobre la uni­dad de volumen Pp = estimativa previa de la fracción volumétrica del componente en estudio e = error patrón relativo que se desea tener asocia­do a la fracción volumétrica
Con el objetivo de determinar diferencias es­tadísticamente significativas, los datos morfomé­tricos obtenidos fueron sometidos a la prueba de Wilcoxon para muestras no paramétricas. Para el cálculo del área nucleolar fue utilizado el software Sigma Pro 5.0

RESULTADOS

En las micrografías electrónicas obtenidas de los tipos celulares tanto normales-proliferantes (HC11 GM) como diferenciadas (HC11 IM) (Figura 1 y 2), se realizaron los análisis morfométricos correspondien­tes. Los valores obtenidos determinaron diferencias estadísticamente significativas (p=0,043; Wilcoxon) con un 95% de confianza y un error de 5%. Teniendo en cuenta que la prueba establece diferencias signifi­cativas con un valor de Z= 2,023 tanto para las longi­tudes como para las áreas que poseen los nucleolos (elegidos al azar) de ambos tipos celulares, indican que efectivamente existen diferencias estadísticamente significativas, situación que permite constatar
la variación de los nucleolos en medida que transcu­rre el mecanismo de diferenciación producto de las estimulaciones lactogénicas (Tablas I y II). En este sentido, en la Figura 3 se describe este resultado evi­denciándose las marcadas diferencias cuantitativas entre ellos, tanto que el volumen cuantificado en la célula proliferante es equivalente, al doble de la en­contrada en la célula en diferenciación. En este mis­mo contexto, la Tabla I describe la diferencia expresa­da en micrones cuadrados de las áreas de nucleolos perteneciente a 5 células HC11 GM elegidas al azar, pudiéndose precisar nuevamente que el organelo es mayor que los encontrados en las 5 células en pro­ceso de diferenciación. Finalmente, en la Tabla II se evidencia la diferencia expresada en micrones corres­pondiente a la longitud de los nucleolos, en células normales y diferenciadas.

DISCUSIÓN

La presencia de nucleolos en las células euca­rióticas argumenta en el sentido que estas son po­seedoras de las materias primas para la realización de biogénesis ribosomal, es decir, la construcción de nuevos ribosomas, organelos en los cuales se producirá la “lectura” del RNAm, generado como producto de la transcripción realizada a expensa del molde de secuencias nucleotídicas del DNA. Por tanto, en términos genéricos es posible argu­mentar que: “grandes nucleolos o mas de uno, in­dica que aquel tipo celular tendrá probabilidad de formar nuevos ribosomas y por ello, la célula se es­pecializará en efectuar síntesis proteica” (9).

De acuerdo al dogma fundamental de la biolo­gía molecular descrito, y considerando que la célula diferenciada sintetiza y secreta activamente tanto ß caseína como proteínas, para la matriz extracelu­lar, podría pensarse “a priori” que esta célula debie­ra presentar abultados o varios nucleolos.
Sin embargo, observando los resultados obtenidos, derivados de la cuantificación morfométrica de
los valores pertenecientes a los nucleolos presen­tes en los tipos celulares HC11 GM y IM, se puede concluir que el tipo celular ya diferenciado presenta una notable disminución, tanto en las fracciones vo­lumétricas y en las áreas, como en la longitud de estos organelos con respecto a los valores encon­trados en la célula normal-proliferante.
En este contexto, en las células HC11 GM, la presencia de grandes nucleolos les imprimen ca­racterísticas generadora de una elevada biogéne­sis ribosomal y se reafirma en el hecho que esta célula posee multitud de ribosomas libres encarga­dos de sintetizar proteínas para el consumo interno representadas por aquellas que participarán en el transcurso de las diferentes etapas de las sucesi­vas mitosis estimuladas por el factor de crecimiento epidérmico. Concomitante con este hecho, ha sido ya demostrado que estas células presentan frac­ciones volumétricas de eucromatina en porcenta­jes muy elevados evidenciando, por ende, que la expresión génica para codificar ARNribosómicos y proteínas para la progresión del proceso mitótico de este tipo celular es también constante y elevada (10).
De igual manera, la notable disminución de la constitución nucleolar evaluada en células ya dife­renciada, se interpreta como que la correspondiente biogénesis ribosomal genera ribosomas que serán mayoritariamente adheridos a las membranas del retículo endoplasmático rugoso (presente en volu­men y porcentaje importante en HC11 IM), lugar en donde se sintetizarán, como ya fue expresado, es­pecifica y exclusivamente proteínas de exportación como ß caseína y otras que constituirán parte de la matriz extra-celular (7,11).
En este sentido, podría argumentarse que en este tipo celular diferenciado, las estimulaciones hormonales lactogénicas pudiesen actuar como moléculas activadoras tanto en la expresión de los genes involucrados en codificar ARNribosómicos como en los de ß caseína solamente en medida que la célula precisara su síntesis y posterior se­creción.